03.01.07 – молекулярная генетика

Специальность
Приказ Высшей аттестационной комиссии Республики Беларусь от 07.06.2016 № 156
 

Цель программы-минимума: создать у аспиранта четкую систему знаний в области молекулярной генетики для использования их в сфере профессиональной деятельности.

Задачи программы-минимума: сформировать у аспиранта комплекс научных знаний по основным вопросам молекулярной генетики, молекулярным механизмам генетических процессов и методам молекулярно-генетического анализа.

Требования к уровню знаний аспиранта: иметь четкие представления о структуре и свойствах нуклеиновых кислот и белков; об основах геномики и генетической инженерии, знать молекулярные механизмы основных генетических процессов. Аспирант должен владеть основами молекулярно-генетического анализа, быть подготовленным теоретически к использованию различных методов молекулярного анализа геномов для решения задач современной генетики и практическому применению полученных результатов; развить способность четко формулировать цель и излагать свою точку зрения по проблеме, планировать и достигать результатов в научной деятельности, проявлять готовность к различным формам и видам научной деятельности (проект, грант, конференция, конгресс, симпозиум, семинар и т.д.).

СОДЕРЖАНИЕ КУРСА

В содержание курса входят основные положения и понятия молекулярной генетики, методы их изучения, молекулярные механизмы генетических процессов и прикладные аспекты молекулярной генетики.

Курс представлен следующими разделами:

  1. Введение.
  2. Структура и свойства нуклеиновых кислот и белков.
  3. Молекулярные механизмы генетических процессов.
  4. Геномика

ВВЕДЕНИЕ

(молекулярная генетика, этапы развития)

Предмет молекулярной генетики. Основные этапы развития молекулярной генетики. Значение молекулярной генетики для решения задач биотехнологии, селекции, медицины, экологии.

СТРУКТУРА И СВОЙСТВА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

(Пуриновые и пиримидиновые основания, азотистые основания, эндо- и экзонуклеазы, макромолекулярная структура ДНК и РНК, ДНК и РНК-содержащие вирусы, структура и классификация белков)

Первичная структура нуклеиновых кислот. Нуклеотиды - мономеры нуклеиновых кислот. Пуриновые и пиримидиновые основания; кето-энольная таутомерия. Сахарный компонент нуклеотида; D-фурановая конфигурация. Нуклеозид; гликозидная связь; фосфатный остаток, его положение. Различные типы нуклеотидов; терминология. Межнуклеотидные связи, полярность линейной цепи. Схема полинуклеотидной цепи: пентозофосфатный каркас и боковые группы.

Химическая и ферментативная деградация нуклеиновых кислот. Эндонуклеазы и экзонуклеазы. ДНКазы и РНКазы. Принцип количественного определения нуклеиновых кислот. Экстракция нуклеиновых кислот и разделение ДНК и РНК. Ультрафиолетовое поглощение нуклеиновых кислот и его применение.

Количественные соотношения азотистых оснований в нуклеиновых кислотах. Правило Чаргаффа. Специфичность количественных соотношений азотистых оснований в нуклеиновых кислотах. Доказательство антипараллельности нитей ДНК. Видовая специфичность состава ДНК и РНК. Физический метод определения состава ДНК. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности.

Нуклеотидная последовательность нуклеиновых кислот и методы ее определения. Азотистые основания и водородные связи между ними.

Макромолекулярная структура ДНК. Двойная спираль Уотсона-Крика. Принцип комплементарности и его биологическое назначение. Реализация водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Регулярность структуры и кооперативность. Спирализация. Параметры спирали. В-, А- и  Z- формы ДНК. Сверхспирализация. Топоизомеразы. Неканонические структуры ДНК.

Денатурация двухспиральной ДНК. Влияние ионной силы, гидрофобных растворителей, мочевины, рН, температуры. Понятие о плавлении спирали; температура "плавления"; связь ее с нуклеотидным составом. Гиперхромный эффект. Кооперативность. Ренатурация ДНК. Условия ренатурации. Зависимость ренатурации от гомогенности препарата.

Молекулярная гибридизация ДНК. Обнаружение гибридных ДНК с помощью тяжелой метки в градиенте плотности хлористого цезия. Установление сходства нуклеотидной последовательности цепей ДНК путем молекулярной гибридизации.

Макромолекулярная структура РНК в растворе. Сходство и отличие конформационных свойств РНК и ДНК: гипохромизм; рентгеноструктурные данные; характеристическая вязкость; температурная зависимость гипохромизма и вязкости; обратимость тепловой денатурации. Одноцепочечность РНК. Спирализация в РНК (вторичная структура). Внутрицепочечные комплементарные взаимодействия. Температурное разрушение ("плавление") спиралей.

Конформации низкомлекулярных РНК. Пространственная структура тРНК. РНК и рибозимы. Однотяжная ДНК и двутяжная РНК вирусного происхождения.

Вирусный нуклеопротеид как форма сохранения инфекционного начала - молекулы нуклеиновой кислоты. ДНК-содержащие и PHK-содержащие вирусы. Типы вирусных нуклеиновых кислот (однотяжные и двутяжные, ДНK и РНК, линейные и кольцевые молекулы).

Первичная структура белков. Аминокислотные остатки - мономеры белковых цепей. Различные типы аминокислот и их строение. Пептидная связь. Полипептидная цепь.

Вторичная структура белков. Основные типы конформаций полипептидной цепи. Спиральные и b-структурные участки в глобулярных белках. Структура домена.

Третичная структура белков. Природа сил, стабилизирующих трехмерную структуру белка. Гидрофобные взаимодействия. Солевые и водородные связи. Вандерваальсовы взаимодействия. Доменная структура. Четвертичная структура белков. Типы взаимодействий между субъединицами в олигомерных белках на примере молекулы гемоглобина.

Классификация белков, основанная на их биологической функции. Ферменты, трансферные белки, запасные белки, сократительные белки, защитные белки крови, токсины, гормоны, структурные белки.

Ферменты. Классификация ферментов. Кофакторы ферментов. Изоферменты. Четвертичная структура изоферментов (лактатдегидрогеназа).

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

(Репликация, рестрикция, репарация, рекомбинация, трансдукция, трансформация, транскрипция, процессинг, сплайсинг, обратная транскрипция, трансляция, генетический код, посттрансляционные и ко-трансляционные изменения белков)

Репликация, рекомбинация и модификация ДНК. Полуконсервативный механизм редупликации. Механизм биосинтеза ДНК. Энзимология репликации. Аналоги обычных оснований, роль в мутагенезе. ДНК-полимеразы (I, II, III) E. сoli. Их ферментативные активности (полимеризующая, 3'-5' и 5'-3' -экзонуклеазные), их роль в синтезе ДНК. ДНК-лигазы. Роль в образовании ДНК. Топоизомеразы. Роль в сверхспирализации.

Регулярная репликация хромосомы бактерий. Понятие о репликоне. Плазмиды: эписомы, бактерицидные факторы, факторы резистентности и токсичности.

Репликация хромосом высших организмов. Множественность репликонов в хромосомах. Амплификация генов рРНК. Геномы митохондрий и пластид, их репликация. Автономно-реплицирующиеся последовательности дрожжей. Молекулярные структуры, центромеры и теломеры. Искусственные хромосомы. Теломера и теломераза. Теломераза, бессмертные клетки и возникновение рака.

Ферментативный синтез РНК на матрице. РНК при вирусной инфекции (РНК-содержащими вирусами). Проблема редупликации вирусной РНК. РНК-зависимая РНК-полимераза. "Вирусная" природа фермента. Бактериальные РНК-содержащие вирусы.

Характер продукта РНК-синтетазной реакции. Нуклеотидный состав и последовательность. Репликативная форма РНК. Ее устойчивость к РНК-азе. Выделение, свойства, комплементарность цепей. "+" и "-" цепи.

Молекулярно-генетические механизмы мутаций. Мутации, возникающие в процессе редупликации ДНК. Возникновение спонтанных мутаций вследствие таутомеризации или ионизации пуринового или пиримидинового кольца в момент репликации. Мутации, индуцированные включением бром-урацила в ДНК. Размножающиеся триплеты и хромосомные болезни.

Точечные мутации, вызываемые прямым химическим изменением нуклеотидов в ДНК. Мутации, вызываемые азотистой кислотой. Генетические и структурные последствия точечных мутаций (аминокислотные замены). Мутации со "сдивигом фазы" (делеции и вставки нуклеотидов). Акридиновые красители как мутагены. Генетические и структурные  последствия мутаций со "сдвигом фазы".

Модификация и рестрикция ДНК. Глюкозилирование ДНК бактериофагов. Метилирование ДНК. Акцепторные азотистые основания, роль последовательности нуклеоитидов. Энзимология метилирования ДНК. Метилирование ДНК фагов и бактерий. Биологическая роль метилирования у прокариот. Рестрикция неметилированной ДНК, ферменты рестрикции и модификации. Генетические и биохимические данные об их структуре, последовательность нуклеотидов, специфичность рестриктаз, механизм их действия.

Репарация повреждений ДНК. Система световой репарации ДНК. Темновая репарация ДНК, ДНК-N-гликозилазы, АР-эндонуклеазы. Эксцизионная репарация. Репарация неспаренных нуклеотидов. SOS-система репарации. Наследственные заболевания человека, основанные на нарушении системы репарации ДНК.

Генетическая рекомбинация. Пол и конъюгация у бактерий. Половой фактор - эписома. Автономное и интегрированное состояние полового фактора. Половые ворсинки. Генетическая структура полового фактора - tra-оперон. Передача ДНК от донорных клеток к реципентньм. Сайт-специфическая рекомбинация, ее механизм и биологическая роль. Сайт-специфическая рекомбинация и реконструирование геномов эукариот.

Молекулярные механизмы трансдукции, трансформации, рекомбинации фагов и эписом. Гипотезы смены матрицы и разрыва-воссоединения. Белки и ферменты рекомбинации. Пострепликативная репарация ДНК. Rec-мутации, нарушающие рекомбинацию. Коррекция при образовании гетеродуплексных молекул ДНК.

Транскрипция. Открытие информационной РHK. Состав новых РНК при развитии бактериофагов. "Ранние" и "поздние" мРНК при развитии Т-фагов.

Понятие об оперонах и полицистронных мРНК. Процессинг РНК у бактерий. РНКаза Р. Безматричный синтез полирибонуклеотидов с помощью полинуклеотидфосфорилазы.

Матричный синтез РНК. Инициация, элонгация и терминация синтеза РНК. Антибиотики - ингибиторы  транскрипции.

"Классическая" схема оперона по Жакобу и Моно. Индукция и репрессия синтеза ферментов. Репрессор лактозного оперона. Эффекторы. Генетическое изучение структуры оперона. Оператор. Структура промоторов генов бактерий.

Слияние оперонов. Позитивная регуляция арабинозного оперона. Катаболитная репрессия, Циклический АМФ и белок-рецептор цАМФ. "Антисмысловая" (antisense)  РНК  в регуляции экспрессии генов.

Регуляция синтеза рибосомных РНК и белков. Единицы транскрипции - предшественники рРНК.

Регуляция транскрипции у эукариот. Три типа РНК-полимераз (I, II и III) животных, особенности структурной организации промоторов транскрибируемых ими генов. Методы "обратной генетики" в исследованиях. Энхансеры (усилители) работы генов. "Сайленсеры".

Данные о регуляторных участках генов. Механизм действия гормонов. Протоонкогены и регуляция транскрипции. Гены, определяющие развитие организма, особенности их строения и экспрессии. Уровни организации ДНК в хромосомах.

Процессинг гигантских предшественников мРНК эукариот. Устранение "интронов" ("сплайсинг"). Образование 3'-концевой полиА и 5'-метил-гуаниловой группы. Роль малых ядерных РНК. Сплайсома. Альтернативный сплайсинг и его роль в регуляции экспрессии генов. Само-"сплайсинг". Транссплайсинг. Редактирование РНК.

Синтез ДНК на матрице РНК ("обратная транскрипция"). Роль обратной транскрипции в эволюции генома. Псевдогены .

Трансляция. Открытие тРНК и процесса акцептирования аминокислот (Хогланд и Замечник, 1959). Характеристика тРНК: длина цепи, концевые группы, универсальная 3’-концевая последовательность. Реакция акцептирования аминоацила. Значение ССА-конца тРНК. Связь аминоацила с тРНК. Ферменты, участвующие в акцептировании.

Аминоацил-тРНК как форма поступления аминокислоты в рибосому. Индивидуальные тРНК. Специфичность тРНК по отношению к различным аминокислотам. Узнавание ферментами индивидуальных тРНК.

Экспериментальная расшифровка генетического кода. Понятие о кодовом отношении, о кодонах, о перекрываемости кодонов, о "запятых", о вырожденности. Экспериментальное доказательство неперекрываемости кодонов с помощью точечных мутаций. Экспериментальное доказательство триплетности кода без запятых с помощью мутаций, индуцированных акридиновыми красителями.

Бесклеточная белок-синтезирующая система и ее компоненты, рибocoмы, матричный полинуклеотид (мРНК), аминоацил-тРНК, ГТФ, белковые факторы, неорганические катионы.

Функциональные центры pибосомы. мРНК-связывающий участок, его локализация на 30S субчастице. Аминоацил-тРНК-связывающий участок рибосомы и его локализация. Пептидил-тРНК-связывающий участок рибосомы и его локализация. Пептидил-трансферазный каталитический центр. Цикличность работы рибосомы.

Этапы трансляции: инициация, элонгация (полимеризация) и терминация. Инициирующие кодоны. Белковые факторы и ГТФ. Образование начального комплекса. Образование первой пептидной связи. Особенности инициации в эукариотических системах. "Полимеризация" аминоацилов, "элонгация". Поступление в рибосомы аминоацил-тРНК. Образование пептидной связи. Транслокация. Общая схема рабочего цикла трансляции. Терминация трансляции, кодоны терминации. Белковые факторы терминации.

Посттрансляционные и ко-трансляционные изменения белков; сигнальные полипептидные последовательности, частичный протеолиз, гликозилирование, АДФ-рибозилирование и другие типы химической модификации белка. Роль фосфорилирования белков в регуляции генной активности. Транспорт белков в системе мембран. Молекулярные "шапероны".

ГЕНОМИКА

(генная карта, цистрон, транспозоны, ретротранспозоны, митохондрии, хлоропласты, ПДРФ-анализ, ПЦР-анализ, клонирование генов, векторы, геномные библиотеки, трансгенные организмы, биобезопасность, биоэтика)

Локализация генов в хромосомах. Принцип линейного расположения генов в хромосоме. Химическая природа генов. Отождествление генов с ДНК. Трансформация бактерий с помощью чистой ДНК.

Многочисленность генов на одной молекуле ДНК. Отождествление гена с ограниченным участком ДНК. Перекрывающиеся гены. Фиксированное расположение генов вдоль молекулы ДНК. Понятие генной карты в применении к молекуле ДНК. Принцип "один ген - один фермент" как следствие развития молекулярной генетики. Дальнейшее развитие гипотезы "один ген - одна полипептидная цепь".

Определение границ гена. Цис-транс-тест и понятие "цистрона"; эквивалентность цистрона и гена. Явление межгенной комплементации как основа теста. Трудности, связанные с возможностью межаллельной комплементации; понятие межаллельной (внутригенной) комплементации.

Замена аминокислоты как структурное проявление мутации гена. Глобиновые мутанты человека. Колинеарность гена и полипептидной цепи белка.

Особенности строения генома эукариот. Общая структура генома. Уникальные и повторяющиеся последовательности ДНК. Сателлитные ДНК. Кинетика ренатурации ДНК. Экзоны и интроны. Эволюция эукариотического генома, представление о перетасовке экзонов. "Процессированные" гены и псевдогены. Роль обратной транскрипции в образовании и эволюции генома эукариот. Мультигенные семейства, их эволюция.

Подвижные генетические элементы генома эукариот, их типы. Ретротранспозоны и транспозоны. Р-элемент. Роль подвижных элементов в возникновении мутаций и геномных перестроек.

Геном митохондрий и хлоропластов. Особенности структурной организации. Их взаимодействие с ядерным геномом.

Методы молекулярного анализа геномов. Анализ ДНК методом Саузерн блот-гибридизации. Анализ РНК Нортен блот-гибридизацией. Анализ белков Вестерн блот-методом. Молекулярные зонды, маркеры. ПДРФ-анализ. Анализ ДНК и РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разновидности ПЦР-анализа. Генетическое картирование геномов. Генетические и физические карты. Сиквенс ДНК, методы сиквенса. Расшифровка нуклеотидного состава генома эукариот (геном человека, геном арабидопсиса).

Генетическая инженерия. Методы клонирования генов. Векторы, используемые для клонирования. Создание геномных библиотек и способы их скрининга. Векторы для генной экспрессии. Библиотеки кДНК. УАК- и ВАС- библиотеки, их значение для клонирования генов. Методы создания трансгенных организмов. Трансгенные животные и растения, их роль в решении общебиологических проблем. Способы оценки экспрессии генов. Использование эндогенных вирусов для переноса генов в клетки животных. Необходимые предосторожности при работах по генной инженерии. Биобезопасность, биоэтика.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

  1. Айала Ф., Кайгер Д. Современная генетика. - М.: Мир, 1987. - Т 1.- 295 с. Т 2 -368 с. Т.3 -335 с.
  2. Льюин Б. Гены. М., "Мир", 1987.
  3. Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. - М.: Высшая школа, 1990.
  4. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск, Сибирское университетское издательство, 2003.- 479с.
  5. Глик Б., Пастернак Дж. «Молекулярная биотехнология». Пер. с англ. Москва. «Мир». 2002.- 589с.
  6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Т.1,2, 1998.
  7. Степанов В. М. Структура и функции белков. М., Высшая школа, 1996.
  8. Жученко А.А, Гужов Ю.Л., Пухальский В.А. и др. Генетика. – М.: Колос, 2004. 480с.
  9. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. – М.: Наука, 2004.  526с.
  10. Картель Н.А., Кильчевский А.В. Биотехнология в растениеводстве. – Мн.: Тэхналогія, 2005. – 309с.
  11. Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Мн.:Тэхналогія, 2003.- 494с.
  12. Свердлов Е.Д. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1. – Наука, 2003. - 427 с.
  13. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск, Сибирское университетское издательство, 2004.- 496с.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА

  1. Альбертс Б. и др. "Молекулярная биология клетки". М., “Мир”, 1994. в 3-х  томах: т. 1, гл. 3, 4, 5; т. 2 гл. 9,10,13; т. 3 гл. 16.
  2. Гвоздев В. А. Подвижные элементы в геноме эукариот. Соросовский образовательный журнал. №8, 1998.
  3. Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология. – М.: Академия, 2005.  400с.
  4. Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, М., " Мир ", 1984.
  5. Транскрипция и трансляция. Методы, Москва, " Мир ", 1987.
  6. Уотсон Дж., Дж.Туз, Д. Курц. Рекомбинантные  ДНК, М., " Мир ", 1986.
  7. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. "Наука", 1984.
  8. Энциклопедия “Современное естествознание». Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов”. М., Изд. Магистр-пресс, 2000.
  9. Гончаренко Г.Г. Основы генетической инженерии. – Мн.: Выш. Шк., 2005.- 183 с.
  10. Николайчик Е.А. Регуляция метаболизма. Курс лекций. Минск. 2002.