03.00.26 – молекулярная генетика

Специальность
Постановление президиума ВАК от 27 июня 2001 г. № 99
 

1. Структура и свойства нуклеиновых кислот и белков

  • Первичная структура нуклеиновых кислот. Нуклеотиды - мономеры нуклеиновых кислот. Пуриновые и пиримидиновые основания; кето-энольная таутомерия. Сахарный компонент нуклеотида;  D-  фурановая конфигурация. Нуклеозид; гликозидная связь; фосфатный остаток, его положение. Различные типы нуклеотидов; терминология. Межнуклеотидные связи, полярность линейной цепи. Схема полинуклеотидной цепи: пентозофосфатный каркас и боковые группы.
  • Химическая и ферментативная деградация нуклеиновых кислот. Эндонуклеазы и экзонуклеазы. ДНКазы и РНКазы. Принцип количественного определения нуклеиновых кислот. Экстракция  нуклеиновых кислот и разделение ДНК и РНК. Ультрафиолетовое поглощение нуклеиновых кислот и его применение.
  • Количественные соотношения азотистых оснований в нуклеиновых кислотах. Правило Чаргаффа. Специфичность количественных соотношений азотистых оснований в нуклеиновых кислотах. Доказательство антипараллельности нитей ДНК. Видовая специфичность состава ДНК и РНК. Физический метод определения состава ДНК. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности.
  • Нуклеотидная последовательность нуклеиновых кислот и методы ее определения. Физико-химические свойства функциональных групп нуклеиновых кислот и возможности нековалентных взаимодействий между ними.
  • Азотистые основания и водородные связи между ними. Азотистые основания и гидрофобные взаимодействия плоскостей колец оснований. Гидрофобные взаимодействия  в полинуклеотидах; стопкообразование.
  • Макромолекулярная структура ДНК. Двойная спираль Уотсона-Крика. Принцип комплементарности и его биологическое назначение. Реализация водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Регулярность структуры и кооперативность. Спирализация. Параметры спирали. В-, А- и  Z- формы ДНК. Сверхспирализация. Топоизомеразы. Неканонические структуры ДНК.
  • Жесткость молекулы ДНК. Оценка жесткости и ее изменений по характеристической вязкости. Механизм гибкости двойных спиралей ДНК. Гипохромизм ДНК. Его связь с упорядоченностью расположения азотистых оснований в молекуле.
  • Денатурация двухспиральной ДНК. Влияние ионной силы, гидрофобных растворителей, мочевины, рН, температуры. Понятие о плавлении спирали; температура "плавления"; связь ее с нуклеотидным составом. Гиперхромный эффект. Кооперативность. Денатурация ДНК как переход спираль-клубок. Профиль плавления. Факторы, определяющие профиль перехода спираль-клубок в гомогенных и гетерогенных химических структурах. Ренатурация ДНК. Условия ренатурации. Зависимость ренатурации от гомогенности препарата.
  • Молекулярная гибридизация ДНК. Обнаружение гибридных ДНК с помощью тяжелой метки в градиенте плотности хлористого цезия. Установление сходства нуклеотидной последовательности цепей ДНК путем молекулярной гибридизации.
  • Макромолекулярная структура РНК в растворе. Сходство и отличие конформационных свойств РНК и ДНК: гипохромизм; рентгеноструктурные данные; характеристическая вязкость; Температурная зависимость гипохромизма и вязкости; обратимость тепловой денатурации. Одноцепочечность РНК. Спирализация в РНК (вторичная структура). Внутрицепочечные комплементарные взаимодействия. Длина и количество спиральных участков. Температурное разрушение ("плавление") спиралей,  профили плавления; зависимость от дефектности и длины спирали.
  • Конформации низкомлекулярных РНК. Пространственная структура тРНК. РНК и рибозимы. Однотяжная ДНК и двутяжная РНК вирусного происхождения.
  • Вирусный нуклеопротеид как форма сохранения инфекционного начала - молекулы нуклеиновой кислоты. Химический состав вирусов и вирусных нуклеопротеидов. ДНК-содержащие и PHK-содержащие вирусы. Типы вирусных нуклеиновых кислот (однотяжные и двутяжные, ДНK и РНК, линейные и кольцевые молекулы).
  • Первичная структура белков. Аминокислотные остатки - мономеры белковых цепей. Различные типы аминокислот и их строение. Пептидная связь. Полипептидная цепь.
  • Вторичная структура белков. Основные типы конформаций полипептидной цепи. Спиральные и b-структурные участки в глобулярных белках. Структура домена.
  • Третичная структура белков. Природа сил, стабилизирующих трехмерную структуру белка. Гидрофобные взаимодействия. Солевые и водородные связи. Вандерваальсовы взаимодействия. Доменная структура. Процесс укладки полипептидных цепей.
  • Четвертичная структура белков. Типы взаимодействий между субъединицами в олигомерных белках на примере молекулы гемоглобина.
  • Классификация белков, основанная на их биологической функции. Ферменты, трансферные белки, запасные белки, сократительные белки, защитные белки крови, токсины, гормоны, структурные белки.
  • Ферменты. Классификация ферментов. Кофакторы ферментов. Изоферменты. Четвертичная структура изоферментов -(лактатдегидрогеназа).

2. Молекулярные механизмы генетических процессов

  • Репликация, рекомбинация и модификация ДНК. Полуконсервативный механизм редупликации (опыт Меселсона и Сталя, 1958). Механизм биосинтеза ДНК. Энзимология репликации. Аналоги обычных оснований, роль в мутагенезе, в ДНК фагов. Точность репликации ДНК и мутантные ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы (I, II, III)  E. сoli. Их ферментативные активности (полимеризующая, 3'-5' и 5'-3' -экзонуклеазные), их роль в синтезе ДНК. ДНК-лигазы. Роль в образовании ДНК. Топоизомеразы. Роль в сверхспирализации.
  • Регулярная репликация хромосомы бактерий. Понятие о репликоне. Репликатор. Регуляция инициации репликации. Терминация репликации и сегрегация реплицировавшихся хромосом. Плазмиды: эписомы, бактерицидные факторы, факторы резистентности и токсичности. Регуляция репликации плазмид.
  • Репликация хромосом высших организмов. Множественность репликонов в хромосомах. Амплификация генов рРНК. Геномы митохондрий и пластид, их репликация. Автономно-реплицирующиеся последовательности дрожжей. Молекулярные структуры, центромеры и теломеры. Искусственные хромосомы. Теломера и теломераза. Теломераза, бессмертные клетки и возникновение рака.
  • Ферментативный синтез РНК на матрице. РНК при вирусной инфекции (РНК-содержащими вирусами). Проблема редупликации вирусной РНК. РНК-зависимая РНК-полимераза. "Вирусная" природа фермента. Бактериальные РНК-содержащие вирусы.
  • Характер продукта РНК-синтетазной реакции. Нуклеотидный состав и последовательность. Репликативная форма РНК. Ее устойчивость к РНК-азе. Выделение, свойства, комплементарность цепей. "+" и "-" цепи. Комплементарный синтез "-" и "+" цепей. "Репликативный интермедиат".
  • Этапы вирусной инфекции при заражении РНК-содержащими бактериофагами, у которых геном представляет собой "+" РНК. "Депротеинизация" вирусной РНК в клетке, соединение вирусной РНК с рибосомами клет­ки хозяина, синтез РНК-синтетазы, репликация "+" и "-" цепей вирусной РНК и дальнейший синтез белков, самосборка вирусных частиц.
  • Особенности репликации РНК у вирусов, у которых геном предоставляет собой "-" РНК и двутяжную РНК.
  • Молекулярно-генетические механизмы мутаций. Мутации, возникающие в процессе редупликации ДНК. Возникновение спонтанных мутаций вследствие таутомеризации или ионизации пуринового или пиримидинового кольца в момент репликации. Мутации, индуцированные включением бром-урацила в ДНК. Размножающиеся триплеты и хромосомные болезни.
  • Точечные мутации, вызываемые прямым химическим изменением нуклеотидов в ДНК. Мутации, вызываемые азотистой кислотой. Генетические и структурные последствия точечных мутаций (аминокислотные  замены). Мутации со "сдивигом фазы" (делеции и вставки нуклеотидов). Акридиновые красители как мутагены. Генетические и структурные  последствия мутаций со "сдвигом фазы".
  • Модификация и рестрикция ДНК. Глюкозилирование ДНК бактериофагов. Метилирование ДНК. Акцепторные азотистые основания, роль последовательности нуклеоитидов. Энзимология метилирования ДНК. Метилирование ДНК фагов и бактерий. Биологическая роль метилирования у прокариот. Рестрикция неметилированной ДНК, ферменты рестрикции и модификации. Генетические и биохимические данные об их структуре, последовательность нуклеотидов, специфичность рестриктаз, механизм их действия.
  • Репарация повреждений ДНК. Система световой репарации ДНК. Темновая репарация ДНК, ДНК-N-гликозилазы, АР-эндонуклеазы. Эксцизионная репарация. Репарация неспаренных нуклеотидов. SOS-система репарации, мутации, нарушающие репарацию у бактерий. Наследственные заболевания человека, основанные на нарушении системы репарации ДНК.
  • Генетическая рекомбинация. Пол и конъюгация у бактерий. Половой фактор - эписома. Автономное и интегрированное состояние полового фактора. Половые ворсинки. Генетическая структура полового фактора - tra-оперон. Передача ДНК от донорных клеток к реципентньм. Механизм встраивания эписомы, умеренного фага и участка хромосомы в геном реципиентных бактерий. Стадии процесса.
  • Молекулярные механизмы трансдукции, трансформации, рекомбинации фагов и эписом. Гипотезы смены матрицы и разрыва-воссоединения. Опыт Меселсона и Уигла. Модель рекомбинации Холлидея. Белки и ферменты рекомбинации. Пострепликативная репарация ДНК. Rec-мутации, нарушающие рекомбинацию. Коррекция при образовании гетеродуплексных молекул ДНК. Генная конверсия, МAT-локус у дрожжей. Механизм соматической рекомбинации при образовании функциональных генов иммуноглобулинов.
  • Сайт-специфическая рекомбинация, ее механизм и биологическая роль. Сайт-специфическая рекомбинация и реконструирование геномов эукариот.
  • Транскрипция. Открытие информационной РHK. Состав новых РНК при развитии бактериофагов. Выделение мРНК из рибосомы (опыты Бреннера и др., Гро и др). "Ранние" и "поздние" мРНК при развитии Т-фагов.
  • Понятие об оперонах и полицистронных мРНК. Процессинг РНК у бактерий. РНКаза Р. Безматричный синтез полирибонуклеотидов с помощью полинуклеотидфос-форилазы. Открытие фермента (Грюнберг-Манаго и Очоа, 1955). Химия реакции. Обратимость (фосфоролиз).
  • Матричный синтез РНК. Инициация, элонгация и терминация синтеза РНК. Антибиотики - ингибиторы  транскрипции. Структура РНК-полимеразы. Роль субъединиц РНК-полимеразы в транскрипции.
  • "Классическая" схема оперона по Жакобу и Моно. Индукция и репрессия синтеза ферментов. Репрессор лактозного оперона. Эффекторы. Генетическое изучение структуры оперона. Оператор. Структура промоторов генов бактерий.
  • Слияние оперонов. Случаи авторегуляции оперонов. Позитивная регуляция арабинозного оперона. Катаболитная репрессия, Циклический АМФ и белок-рецептор цАМФ. Изучение регуляции активности оперонов в системе сопряженной транскрипции и трансляции. Белки-активаторы и их акцепторные зоны в опероне, ее нуклеотидная последовательность и структурные взаимоотношения с промотором и оператором. "Антисмысловая" (antisense)  РНК  в регуляции экспрессии генов.
  • Регуляция синтеза рибосомных РНК и белков. Единицы транскрипции - предшественники рРНК. Роль гуанозинтетра- и гуанозинпента-фосфатов, механизм их образования в рибосомах.
  • Регуляция транскрипции у эукариот. Три типа РНК-полимераз (I, II и III) животных, особенности структурной организации промоторов транскрибируемых ими генов. Электронно-микроскопическое исследование транскрипции. Методы "обратной генетики" в исследованиях. Энхансеры (усилители) работы генов. "Сайленсеры". Базальная и индуцированная транскрипция у эукариот. Белковые факторы транскрипции. Их типы. Структурные мотивы эукариотических факторов транскрипции. Активные транскрипционные комплексы.
  • Данные о регуляторных участках генов. Механизм действия гормонов. Протоонкогены и регуляция транскрипции. Гены,  определяющие развитие организма, особенности их строения и экспрессии. Морфогенетические градиенты и факторы транскрипции. Уровни организации ДНК в хромосомах.
  • Процессинг гигантских предшественников мРНК эукариот. Устранение "интронов" ("сплайсинг"). Образование 3'-концевой полиА и 5'-метил-гуаниловой группы. Роль малых ядерных РНК. Сплайсома. Альтернативный сплайсинг и его роль в регуляции экспрессии генов. Выбор сигналов полиаденилирования в регуляции процессинга. Интроны в предшественниках рибосомной РНК и генах органелл. Само-"сплайсинг". Транссплайсинг. Редактирование РНК.
  • Синтез ДНК на матрице РНК ("обратная транскрипция"). Роль обратной транскрипции в эволюции генома. Псевдогены .

3. Геномика

  • Локализация генов в хромосомах. Принцип линейного расположения генов в хромосоме. Химическая природа генов. Отождествление генов с ДНК. Трансформация бактерий с помощью чистой ДНК. Опыт Эвери, Мак-Леода и Мак-Карти (1944) . Заражение бактерии фаговой ДНК. Опыт Херши и Чейз (I952).
  • Многочисленность генов на одной молекуле ДНК. Пример с ДНК бактериофага. Отождествление гена с ограниченным участком ДНК. Перекрывающиеся гены. Фиксированное расположение генов вдоль молекулы ДНК. Понятие генной карты в применении к молекуле ДНК. Принцип "один ген - один фермент" как следствие развития молекулярной генетики. Дальнейшее развитие гипотезы  "один ген - одна полипептидная цепь".
  • Определение границ гена. Цис-транс-тест и понятие "цистрона"; эквивалентность цистрона и гена. Явление межгенной комплементации как основа теста. Трудности, связанные с возможностью межаллельной комплементации; понятие межаллельной (внутригенной) комплементации.
  • Замена аминокислоты как структурное проявление мутации гена. Глобиновые мутанты человека. Колинеарность гена и полипептидной цепи белка.
  • Особенности строения генома эукариот. Общая структура генома. Уникальные и повторяющиеся последовательности ДНК. Сателлитные ДНК. Кинетика ренатурации ДНК. Экзоны и интроны. Эволюция эукариотического генома, представление о перетасовке экзонов. "Процессированные" гены и псевдогены. Роль обратной транскрипции в образовании и эволюции генома эукариот. Мультигенные семейства, их эволюция.
  • Подвижные генетические элементы генома эукариат, их типы. Ретротранспозоны и транспозоны. Р-элемент. Роль подвижных элементов в возникновении мутаций и геномных перестроек.
  • Геном митохондрий и хлоропластов. Особенности структурной организации. Их взаимодействие с ядерным геномом. Регуляция молекулярно-генетических процессов на уровне генома.
  • Методы молекулярного анализа геномов. Анализ ДНК методом Саузерн блот-гибридизации. Анализ РНК Нортен блот-гибридизацией. Анализ белков Вестерн блот-методом. Анализ ДНК и РНК с помощью полимеразной цепной реакции. Генетическое картирование геномов. Генетические и физические карты. Молекулярные зонды маркеры. ПДРФ- и РАПД-анализы. Сиквенс ДНК, методы сиквенса. Расшифровка нуклеотидного состава генома эукариот (геном человека, геном арабидопсиса).
  • Трансляция. Открытие тРНК и процесса акцептирования аминокислот (Хогланд и Замечник, 1959). Характеристика тРНК: длина цепи, концевые группы, универсальная 3’-концевая последовательность. Реакция акцептирования аминоацила. Значение ССА-конца тРНК. Связь аминоацила с тРНК. Ферменты, участвующие в акцептировании.
  • Аминоацил-тРНК как форма поступления аминокислоты в рибосому. Индивидуальные тРНК. Специфичность тРНК по отношению к различным аминокислотам. Узнавание ферментами индивидуальных тРНК. Методы разделения индивидуальных тРНК: колоночная xроматorpaфия, противоточное распределение, химические методы. О гетерогенности тРНК с одинаковой специфичностью к аминокислоте (множественность изоакцепторньх тРНК).
  • Экспериментальная расшифровка генетического кода. Понятие о кодовом отношении, о кодонах, о перекрываемости кодонов, о "запятых", о вырожденности. Экспериментальное доказательство неперекрываемости кодонов с помощью точечных мутаций.  Экспериментальное доказательство триплетности кода без запятых с помощью мутаций, индуцированных акридиновыми красителями.
  • Бесклеточная белок-синтезирующая система и ее компоненты, рибocoмы, матричный полинуклеотид (мРНК), аминоацил-тРНК, ГТФ, белковые факторы, неорганические катионы. Краткая характеристика компонентов. О белок-синтезирующей системе в клетке.
  • Функциональные центры pибосомы. мРНК-связывающий участок, его локализация на 30S субчастице. Аминоацил-тРНК-связывающий участок рибосомы и его локализация. Пептидил-тРНК-связывающий участок рибосомы и его локализация. Пептидил-трансферазный каталитический центр. ГТФазная активность комплексов рибосомы с белковыми факторами. Общая характеристика трансляции. Динамическая модель работы рибосомы. Полярность трансляции. Удержание растущего пептидила на рибосоме. Субстраты реакции и химия реакции образования пептидной связи. Цикличность работы рибосомы.
  • Этапы трансляции: инициация, элонгация (полимеризация) и терминация. Инициаторная формилметионил-тРНК. Инициирующие кодоны. Белковые факторы и ГТФ. Образование начального комплекса. Образование первой пептидной связи. Инициация в системах с синтетическими матрицами без инициирующих кодонов. Особенности инициации в эукариотических системах. "Полимеризация" аминоацилов, "элонгация". Белковые факторы и ГТФ. Поступление в рибосомы аминоацил-тРНК. Образование пептидной связи. Транслокация. Общая схема рабочего цикла трансляции. Понятие о ложном кодировании в процессе элонгации. Терминация трансляции, кодоны терминации. Белковые факторы терминации.
  • Посттрансляционные и ко-трансляционные изменения белков; сигнальные полипептидные последовательности, частичный протеолиз, гликозилирование, изомеризация пролина, АДФ-рибозилирование и другие типы химической модификации белка. Роль фосфорилирования белков в регуляции генной активности. Транспорт белков в системе мембран. Молекулярные "шапероны".

4. Генетическая инженерия

  • Методы клонирования генов. Векторы, используемые для клонирования. Создание геномных библиотек и способы их скрининга. Векторы для генной экспрессии. Библиотеки кДНК. УАК- и ВАС- библиотеки, их значение для клонирования генов. Сайт-специфический мутагенез. Методы обратной генетики. Методы создания трансгенных организмов. Трансгенные животные и растения, их роль в решении общебиологических проблем. Способы оценки экспрессии генов. Использование эндогенных вирусов для переноса генов в клетки животных, необходимые предосторожности при работах по генной инженерии.

Литература

  1. Айала Ф.,nbsp;Кайгер Д. Современная генетика. - М.: Мир, 1987. - Т 1.- 295 с. Т 2 -368 с. Т.3 -335 с.
  2. Инге-Вечтомов С.Г. Введение в молекулярную генетику. - М.: Высшая школа,  1993.
  3. Льюин Б. Гены. М., "Мир", 1987.
  4. Молекулярная биология и биосинтез нуклеиновых кислот. Высшая школа, I990.
  5. Степанов В. М. Структура и функции белков. М., Высшая школа, 1996.
  6. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. Т.1,2, 1998.
  7. Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. - М.: Высшая школа, 1990.

Дополнительная литература

  1. Альбертс Б. и др. "Молекулярная биология клетки". М., “Мир”, 1994. в 3-х  томах: т. 1, гл. 3, 4, 5; т. 2 гл. 9,10,13; т. 3 гл. 16.
  2. Гвоздев В. А. Подвижные элементы в геноме эукариот. Соросовский образовательный журнал. №8, 1998.
  3. Гершензон С. М. Основы современной генетики. – Киев: Наукова думка, 1983. – 560 с.
  4. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот, М., "Мир", 1971.
  5. Картель Н.А. Биоинженерия: методы и возможности. - Мн.: Ураджай, 1989. - 143 с.
  6. Корнберг А. Синтез ДНК. М., "Мир", 1977.
  7. Ленинджер А.. Основы биохимии в 3-х т. М., "Мир", 1985.
  8. Маниатис Т., Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, М., " Мир ", 1984.
  9. Стент Г., Р.Кэлиндар. Молекулярная генетика, М., " Мир", I98I
  10. Транскрипция и трансляция. Методы, Москва, " Мир ", 1987.
  11. Уотсон Дж., Дж.Туз, Д. Курц. Рекомбинантные  ДНК, М., " Мир ", 1986.
  12. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. "Наука", 1984.
  13. Картель Н.А., Макеева Е.Н., Мезенко А.М. Генетика: энциклопедический словарь. Минск, Изд. Технология, 1999.- 447 с.
  14. Энциклопедия «Современное естествознание.Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов». М., Изд. Магистр-пресс, 2000